2 курс / Биохимия / Обмен белков и ферменты

– объяснять выбор условий при проведении электрофореза. Студент должен владеть информацией об изменениях биохи-

мических показателей с учетом знания механизмов развития патологии при действии вредных факторов окружающей среды.

Вопросы для самоподготовки

1.Характеристика белков по растворимости.

2.Типы растворов белков. Свойства белковых растворов. Диализ.

3.Факторы устойчивости растворов белков.

4.Виды осаждения белков.

5.Факторы и механизм высаливания.

6.Факторы и механизм денатурации.

7.Практическое использование осадочных реакций.

8.Заряд белковой молекулы, от чего он зависит.

9.Изоэлектрическое состояние белка, изоэлектрическая точка.

10.Методы разделения белков (высаливание нейтральными солями, хроматография, гель-фильтрация, ультрацентрифугирование, изоэлектрофокусирование, температурная денатурация, иммунологические методы, электрофорез). Их принципы.

11.Белки плазмы крови. Белковые фракции крови, норма.

12.Значение определения белковых фракций крови в практике врача.

Задания для самоподготовки

1.Изучить рекомендуемую литературу, используя вопросы для самоподготовки.

2.Составить и записать в рабочей тетради в виде таблицы факторы осаждения белков, отразив механизмы осаждения и практическое использование.

3.Написать в рабочей тетради схемы ионизации основных и нейтральных белков при различных рН.

4.Составить и записать в рабочей тетради в виде таблицы белковые фракции сыворотки крови, отразив состав фракции и нормальные значения.

Рекомендуемая литература

Основная

Березов, Т.Т. Биологическая химия / Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин. – М. :

Медицина, 1998. – С. 23–32, 44–49, 568–574, 577–578.

31

Биохимия : учебник для вузов / под ред. проф. Е.С. Северина. – М. :

ГЭОТАР-МЕД, 2003. – С. 28–30, 36–38, 67–73, 682–686; То же. – 2011. – С. 28– 30, 35–38, 66–73.

Белки и ферменты : учебно-методическое пособие к практическим занятиям по биологической химии / под ред. проф. В. А. Дадали, доц. Р.Н. Пав-

ловой. – СПб. : Изд-во СЗГМУ им. И.И. Мечникова, 2013.

Дополнительная Марри, Р. Биохимия человека ; т. 1 / Р. Марри, Д. Греннер, П. Мейес,

В. Родуэлл. – М. : Мир, 1993. – С. 29–32, 34–41, 48–51.

Таганович, А.Д. Биологическая химия / А.Д. Таганович. – Минск : Асар;

М. : БИНОМ, 2008. – С. 12–13, 18–28.

Глоссарий

Высаливание – обратимое выделение в осадок растворенного белка, вызываемое добавкой к раствору достаточных количеств другого вещества, обладающего дегидратирующим действием, например сульфата аммония, хлорида кальция, хлорида натрия или калия, ацетона, 70º алкоголя.

Гель-фильтрация – метод разделения смеси веществ с различными молекулярными массами путем фильтрации через различные ячеистые гели, так называемые молекулярные сита.

Гидратная оболочка – слой молекул воды, определенным образом ориентированных на поверхности белковой молекулы.

Денатурация (от лат. де – удаление и лат. natura – природные свойства) – необратимые изменения природной (нативной) структуры молекулы белка, приводящие к изменению физических и биологических свойств белка.

Диализ (от греч. diálysis – разложение, отделение) – удаление из коллоидных систем и растворов высокомолекулярных соединений примесей низкомолекулярных веществ с помощью полупроницаемых мембран.

Изоэлектрическая точка – значение рН, при котором заряд белка равен нулю.

Изоэлектрическое состояние – состояние белка, когда его заряд равен нулю.

Тяжелые металлы – группа химических элементов со свойствами металлов и значительной атомной массой (более 50) либо плотностью (более 8 г/см2), например, ртуть(Hg) , свинец (Pb), кадмий (Cd), медь (Cu), серебро

(Ag).

Ультрацентрифугирование – метод разделения и осаждения частиц размером менее 100 нм под действием центробежных сил (~100 000 g, где g – ускорение силы тяжести).

Электрофорез – метод разделения смеси белков, основанный на их способности двигаться под действием электрического постоянного поля в зависимости от заряда белка.

32

Пример входного контроля

I. Выберите правильные ответы:

1.Вид осаждения из раствора и конкретный механизм осаждающего фактора, если осаждающим фактором является перекись водорода.

Вид осаждения: 1) обратимое; 2) необратимое.

2.Механизм действия осаждающего фактора:

а) изменение гидратации молекул белка;

б) изменение ионизации групп (NН2, COOH) при сдвигах рН среды; в) связывание функциональных групп белка (NH2, NH, OH, SH);

г) окислительно-восстановительное превращение SH-групп и S–S связей;

д) усиление колебательных движений отдельных фрагментов полипептидной цепи, разрыв гидрофобных, водородных связей в молекуле белка.

II. Какова растворимость основных белков в слабокислой среде? Напишите схему ионизации, укажите суммарный заряд молекулы.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

Обратимое и необратимое осаждение белка. Диализ. Фракционное разделение белков. Электрофорез

Реактивы и оборудование: 1) штативы для пробирок; 2) водя-

трия – 10 %; 9) раствор ацетата свинца-II – 5 %; 10) раствор сульфосалициловой кислоты – 20 %; 11) азотная кислота концентрированная; 12) раствор сульфата аммония – 5 %; 13) сульфат аммония кристаллический; 14) раствор нитрата серебра 1 %.

Обратимое и необратимое осаждение белков (высаливание и денатурация)

Ход работы. Берут штатив с 5 пробирками и в каждую отмеривают по 5 капель раствора яичного белка. Первую пробирку помещают на 2– 3 мин в кипящую водяную баню. Во вторую пробирку добавляют по каплям (5–6 капель) соль тяжелого металла (ацетата свинца). В третью пробирку раствор азотной кислоты. В четвертую – раствор сульфасали-

33

циловой кислоты. В пятую пробирку – раствор сульфата аммония. Наблюдают появление осадков во всех пробирках. Затем во все пробирки добавляют дистиллированную воду, в объеме, равном содержимому пробирок, встряхивают и наблюдают, растворились ли осадки, после этого делают выводы о типе осаждения белка в каждой пробирке (денатурации или высаливании).

Результаты работы оформляют в виде табл. 5.

Диализ

Ход работы. В 2 пробирки наливают раствор яичного белка, содержащего примесь хлорида натрия; в одной делают биуретовую реакцию, в другой – реакцию на ионы хлора с нитратом серебра в присутствии азотной кислоты – 5 капель белка + 3 капли AgNO3. В двух других пробирках делают те же реакции с дистиллированной водой. Раствор яичного белка наливают в диализатор, который погружают в стакан с дистиллированной водой. Через 1 ч вынимают диализатор из стакана и вновь проделывают биуретовую реакцию и реакцию на ионы хлора с диализатом и раствором яичного белка (диализируемой жидкостью) (табл. 6).

Вывод: _____________________________________________.

34

Фракционное высаливание белков. Разделение альбуминов и глобулинов

Ход работы. К 1 мл раствора белка добавляют равный объем (1 мл) насыщенного (50 %) раствора сульфата аммония, хорошо перемешивают и оставляют на 10 мин для более полного осаждения белка. Через 10 мин образовавшийся осадок отфильтровывают через складчатый фильтр. В фильтрат добавляют крупинки кристаллического сульфата аммония до появления осадка (образуется 100 % раствор сульфата аммония) (табл. 7).

Вывод: _____________________________________________.

Электрофорез

Вплазме крови человека содержится 65–85 г/л белка, представленного различными по своему происхождению и свойствам фракциями. При различных острых и хронических заболеваниях, а также в результате действия многих повреждающих факторов внешней среды, таких, как тяжелые металлы, окислители, органические растворители, хлорпроизводные, фосфорорганические соединения, вибрация, ультразвук и др. происходит изменение содержания в крови не только общего белка, но и белковых фракций (диспротеинемия). Выявление таких изменений имеет существенное клинико-диагностическое значение.

Вразделении белковых фракций сыворотки крови основное значение принадлежит электрофорезу. Принцип этого метода основан на способности заряженных частиц (в том числе белков) перемещаться под действием электрического поля в зависимости от знака их заряда.

Скорость движения частиц в электрическом поле зависит от: 1) величины суммарного заряда частиц; 2) размера и формы частиц; 3) силы электрического тока и напряжения;

4) свойств носителя, на котором проводят разделение;

35

5)рН буферного раствора;

6)температуры.

Виды электрофореза:

1.По направлению движения частиц основными являются два вида электрофореза – горизонтальный и вертикальный.

2.По приборному оформлению:

–на пластинках;

–в трубочках;

–в колонках;

–капиллярный.

3.По используемому носителю:

– на бумаге;

– на ацетатцеллюлозных мембранах;

– в геле (крахмальном, агарозном, полиакриламидном);

– без поддерживающей среды.

4.По интенсивности электрического поля:

–низковольтный (при используемом напряжении менее 500 В);

–высоковольтный (при напряжении более 500 В).

Техника электрофореза впервые была предложена Тизелиусом в 1937 г. Для проведения электрофореза требуются: источник постоянного тока и камера, заполненная буфером. Камера состоит из двух сообщающихся отделений: в одном находится электрод, в другом – конец поддерживающей среды, на которую наносится исследуемый материал (сыворотка крови).

Выбор буферного раствора определяется характером заряда исследуемых веществ. Для разделения сывороточных белков используют буферы с рН 8,6 (например, мединал-вероналовый). При такой величине рН молекулы белка заряжены отрицательно, и их движение направлено к аноду.

В качестве поддерживающей среды для электрофореза используются:

1.Фильтровальная бумага: разделение проводится при низком напряжении поля, поэтому длится 16–18 ч, границы между отдельными фракциями получаются нечеткими, можно получить 5 основных белковых фракций сыворотки крови.

2.Пленки из ацетатцеллюлозы: дорогостоящие, разделение занимает меньше времени (30–40 мин), более эффективно. Получают также 5 фракций. Широко применяются для разделения и идентификации липопротеинов, изоферментов, гемоглобинов и для разделения белков мочи.

36

3.Агар и агарозный гель: представляют собой гетерополисахариды, менее дорогостоящие, чем ацетатцеллюлозные пленки, по эффективности не уступают им, разделение занимает около 90 мин; используются также при иммуноэлектрофорезе.

4.Крахмальный гель: обладает всеми преимуществами других гелей, характерен эффект молекулярного сита; используется в основном для предварительного разделения смеси белков.

5.Полиакриламидный гель: наиболее широко применяется; обладает высоким эффектом молекулярного сита; высокая эффективность разделения; можно получить до 20 белковых фракций сыворотки крови и более.

Этапы электрофореза.

1.На смоченную в буфере поддерживающую среду (носитель) наносят исследуемые пробы и помещают в камеру, заполненную буфером.

2.Подключают электроды и пропускают электрический ток, в течение определенного времени (зависит от поддерживающей среды) проводят разделение.

3.Фиксация проб с помощью ацетона, метанола или высокой температуры.

4.Окрашивание проб с помощью красителей (амидо черный, бромфеноловый синий, пунцовый S).

5.Удаление избытка красителя. Промывка электрофореграмм.

6.Определение процентного содержания фракций белка:

–сканирование электрофореграмм с помощью денситометра. В денситометре свет проходит через гель, поглощение света прямопропорционально количеству белка;

–элюирование окраски из основы с последующим колориметрическим измерением поглощения растворов. Но этот метод более трудоемкий и менее точный, в настоящее время не используется в клинической практике.

7. Оценка полученных результатов (в сыворотке крови человека в норме содержится альбуминов – 55–65 %; глобулинов α1 – 2–5 %; глобулинов α2 – 6–11 %; глобулинов β – 11–15 %; глобулинов γ – 15–22 %).

Осадочные пробы на белок

Поскольку количественное исследование фракционного состава белков плазмы трудоемко и нуждается в сложной аппаратуре, его часто заменяют качественными диспротеинемическими тестами. Они основа-

37

ны на разной чувствительности отдельных белков плазмы крови к действию осаждающих агентов. Такие тесты позволяют оценить тяжесть патологического состояния и эффективность лечения, проследить динамику заболевания.

Установлено, что положительный результат коллоидно-химических проб чаще вызывается количественными изменениями в глобулиновых фракциях или изменением соотношения альбумины / глобулины, то есть он связан с увеличением содержания глобулинов либо уменьшением уровня альбуминов.

К коагуляционным тестам относятся реакции с сульфатом кадмия и цинка, тимоловая проба, реакция Гросса с хлоридом ртути (сулемовая проба), реакция Вельтмана с хлоридом кальция.

Наиболее часто используется тимоловая проба. Она основана на определении степени помутнения с помощью ФЭКа при взаимодействии сыворотки с насыщенным раствором тимола в вероналовом буфере. Причиной помутнения является взаимодействие молекул тимола и некоторых крупнодисперстных белков: γ-глобулинов и β-липопротеинов. Эта реакция связана с образованием глобулино-тимол-липидного комплекса. Норма: 0–4 ед. помутнения.

Тимоловая проба положительная у 90–100 % больных болезнью Боткина, токсическим гепатитом, а также у больных с постгепатитным и постнекротическим циррозом, коллагенозами, малярией и вирусными инфекциями. При механической желтухе проба в 75 % случаев отрицательная. Она становится положительной лишь в том случае, если процесс осложняется паренхиматозным гепатитом.

Применение осадочных реакций в других областях представлено в табл. 8.

38

ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ

ВЫБЕРИТЕ ПРАВИЛЬНЫЙ ОТВЕТ

1. МЕХАНИЗМ ОСАЖДАЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ТЕМПЕРАТУРЫ 100° С

а) изменение гидратации молекул белка

б) изменение ионизации групп (NH2, COOH) при сдвигах рН в) связывание функциональных групп белка (SH, NH2, OH, NH)

г) окислительно-восстановительное превращение SH-групп и S–S- связей

д) усиление колебательных движений отдельных фрагментов полипептидной цепи

2. МЕХАНИЗМ ОСАЖДАЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ХЛОРИДА РТУТИ

а) изменение гидратации молекул белка

б) изменение ионизации групп (NH2, COOH) при сдвигах рН в) связывание функциональных групп белка (SH, NH2, OH, NH)

г) окислительно-восстановительное превращение SH-групп и S–S- связей

д) усиление колебательных движений отдельных фрагментов полипептидной цепи

39

3. МЕХАНИЗМ ОСАЖДАЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ СУЛЬФАТА АММОНИЯ

а) изменение гидратации молекул белка

б) изменение ионизации групп (NH2, COOH) при сдвигах рН в) связывание функциональных групп белка (SH, NH2, OH, NH)

г) окислительно-восстановительное превращение SH-групп и S–S- связей

д) усиление колебательных движений отдельных фрагментов полипептидной цепи

4.МЕХАНИЗМ ОСАЖДАЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ПЕРМАНГАНАТА КАЛИЯ

(KMnO4)

а) изменение гидратации молекул белка

б) изменение ионизации групп (NH2, COOH) при сдвигах рН в) связывание функциональных групп белка (SH, NH2, OH, NH)

г) окислительно-восстановительное превращение SH-групп и S–S- связей

д) усиление колебательных движений отдельных фрагментов полипептидной цепи

5. МЕХАНИЗМ ОСАЖДАЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ НАТРИЯ ХЛОРИСТОГО (NACl)

а) изменение гидратации молекул белка

б) изменение ионизации групп (NH2, COOH) при сдвигах рН в) связывание функциональных групп белка (SH, NH2, OH, NH)

г) окислительно-восстановительное превращение SH-групп и S–S- связей

д) усиление колебательных движений отдельных фрагментов полипептидной цепи

6. МЕХАНИЗМ ОСАЖДАЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ АЦЕТОНА

а) изменение гидратации молекул белка

б) изменение ионизации групп (NH2, COOH) при сдвигах рН в) связывание функциональных групп белка (SH, NH2, OH, NH)

г) окислительно-восстановительное превращение SH-групп и S–S- связей

д) усиление колебательных движений отдельных фрагментов полипептидной цепи

7.МЕХАНИЗМ ОСАЖДАЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ СУЛЬФОСАЛИЦИЛОВОЙ КИСЛОТЫ

а) изменение гидратации молекул белка

б) изменение ионизации групп (NH2, COOH) при сдвигах рН в) связывание функциональных групп белка (SH, NH2, OH, NH)

40