Метод Крамаренко.
Частный метод изолирования алкалоидов водой, подкисленной серной кислотой (по В.Ф.Крамаренко)
Схема метода состоит из следующих этапов:
1).Настаивание измельченного объекта с водой, подкисленной 20% раствором серной кислоты до рН2-3, в течение двух часов. Вода берется в количестве 1:2 по отношению к навеске объекта. Водное извлечение фильтруется. Операция повторяется двукратно.
2).Очистка водного извлечения от белковых соединений путем насыщения его сульфатом аммония, настаивания в течение часа и фильтрования образовавшегося осадка.
3).Очистка фильтрата от жиров, смол, пигментов путем экстракции эфиром. Эфирное извлечение отбрасывают.
4).Подщелачивание водного извлечения 20% раствором гидроксида натрия и экстрагирование веществ основного характера хлороформом при рН=9-10 (трехкратная экстракция), отделение органической фазы и концентрирование полученного извлечения упариванием.
Достоинства:
1. Частный метод ля алкалоидов, для синтетических веществ основного характера.
2. Быстро.
3. Вытяжка получается чистая.
Недостатки:
1. Для веществ кислого характере – не подходит. Для некоторых групп алкалоидов – плохое извлечение.
Классификация иммунохимических методов. Основные этапы.
Выделяют следующие виды иммунохимического анализа:
Метод |
Способ детектирования |
Иммуноферментный анализ (ИФА) |
Ферментная активность |
Иммуносенсорные методы |
Электрический сигнал |
Иммунохроматографический анализ (ИХА) |
Образование окрашенного комплекса |
Люминесцентный иммуноанализ (ЛИА) |
Интенсивность люминесценции |
Флуоресцентно-поляризационный иммуноанализ (ФПИА) |
Интенсивность флуоресцентной поляризации |
Радиоиммунный анализ (РИА) |
Радиоактивность |
Металлоиммуноанализ (МИА) |
Атомарные спектры поглощения |
Рефрактометрический иммуноанализ |
Преломление света |
Все методы иммунохимического исследования включают 4 этапа. 1 этап. Нанесение метки на препарат или его аналог. 2 этап. Добавление антисыворотки с антителами и образование комплекса антителомеченый препарат. 3 этап. Добавление исследуемого образца (крови, мочи). Происходит вытеснение токсическим веществом меченого препарата из комплекса и образование нового комплекса: анализируемое вещество-антитело. 4 этап. Измерение радиоактивности, интенсивности флуоресценции, активности фермента и т.д.
Основные преимущества ихм. Типы применяемых меток и способы их детектирования.
В основе иммунохимических методов анализа лежит высокоспецифичная и высокочувствительная иммунная реакция антигена с антителами.
Основные достоинства иммуно-химических методов
Определение производится непосредственно в биологической жидкости
Не требует изолирования и очистки
Позволяет одновременно производить анализ на большое количество проб
Просты в исполнении
Высокочувствительные
Высокая скорость определения
Возможность автоматизации и использования для массовых анализов в полевых условиях
Высокая точность
Не требуется дорогостоящее оборудование
Метки, используемые в ИХА. В качестве меток в ИХА используются различные вещества и частицы.
1. Красящие вещества (хромогенные субстраты) - нано-частицы коллоидного золота или углерода, или частицы окрашенного латекса.
2. Люминофоры (Флуоресцентные, фосфоресцентные и биолюминисцентные метки, ковалентно связанные с частицами латекса). Эти метки используются только в приборных вариантах ИХА. Среди вышеуказанных наиболее распространены флуоресцентные метки.
3. Парамагнитные метки (также закрепленные на частицах латекса). Данный вид меток используется в ИХА с применением приборов, регистрирующих силу магнитного поля.
4. Ферментные метки. Ферментативная реакция регистрируется с помощью окрашивания субстратов, и результат анализа является визуальным.
5) Новым направлением в разработке различных разновидностях ИХА является использование липосом в качестве носителей различного рода меток (красящих, флуоресцентных, ферментативных, электроактивных и пр.)
6) Радионуклиды – используют изотопы I, Au, P
Иммунохроматографический тест сочетает в себе хроматографию в тонком слое (ТСХ) и принципы иммунохимии.
В тест-зоне полоски нанесены искусственные антигены. Антитела к ним, связанные с красителем, также нанесены на полоску у линии ее погружения в исследуемый образец биожидкости. При погружении тест-полоски в биожидкость происходит ее миграция по принципу ТСХ. Вместе с биожидкостью движутся антитела. Если в биожидкости отсутствует исследуемый антиген, то антитела доходят до искусственных антигенов, связываются с ними, и в тест-зоне появляется окрашивание. Если исследуемый антиген присутствует в биожидкости, он связывает антитела и окрашивания в тест-зоне не наблюдается.